丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

• 作者: 侯利华 杜桂鑫 王海涛
• 来源期刊: 中华传染病杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肝炎病毒,丙型 丝氨酸蛋白酶 昆虫细胞 去垢剂
• 年，卷（期）: 2002,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 10-13
• 页数: 5页
• 分类号: R37
• 字数: 3938字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j.issn:1000-6680.2002.01.003

摘要

目的利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白酶结构域(protease domain)的重组蛋白.方法构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体pFBCNS3N,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒.用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni-NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白)为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性.结果 HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液;从5×107细胞中总共获得0.2mg重组蛋白,纯度大于90%;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段;血清学实验证实该蛋白抗原性很好.结论昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白,具有良好的酶学活性以及抗原性.