应用竞争PCR定量检测猪IFN-γmRNA

• 作者: 仇华吉 兰文生 吴东来 周艳君 王云峰 童光志 郭海龙
• 来源期刊: 中国兽医学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 猪IFN-γ 竞争PCR 内对照 嵌入光密度
• 年，卷（期）: 2003,（3）
• 所属期刊栏目: 基础兽医学
• 页码范围: 278-280
• 页数: 3页
• 分类号: Q78
• 字数: 2712字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-4545.2003.03.025

摘要

运用RT-PCR从经ConA体外刺激培养的猪外周血单核细胞(PBMC)提取的细胞总RNA中扩增猪γ-干扰素(IFN-γ)的部分片段,经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段,将余下的2个较大片段连接,并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物,从而获得截短的同源性片段.将其纯化后克隆于pMD18-T载体,重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行序列测定,验证无误后作为竞争性模板内对照,一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的PBMC总RNA反转录产物进行PCR,产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭(EB)嵌入光密度值(IOD),经校正后取上述两者比值的对数值作为Y轴,取已知竞争模板相应浓度的对数值作为X轴,绘制成竞争曲线.应用建立的竞争PCR对不同样品重复试验表明,本方法操作简单,结果可靠,稳定性高,适用于猪IFN-γ mRNA的定量检测.