重组腺相关病毒转导NIH3T3建立神经生长因子真核表达细胞株的研究

• 作者: 刘淼 杨广笑 王全颖 马巍
• 来源期刊: 中国脊柱脊髓杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 重组腺相关病毒(rAAV) 人神经生长因子(hNGF) NIH3T3细胞株 真核表达 生物活性
• 年，卷（期）: 2004,（9）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 542-546
• 页数: 5页
• 分类号: Q789
• 字数: 4624字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-406X.2004.09.008

摘要

目的:探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)转导美国国家健康研究中心建系的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,NIH3T3)建立神经生长因子β(nerve growth factor subunitβ,NGFβ)真核表达细胞株可行性,并检测其生物活性.方法:使用表达NGFβ的重组腺相关病毒感染NIH3T3细胞,取感染重组病毒的3T3细胞培养基上清,经表达蛋白提取和浓缩,肝素-Sepharose CL-6B亲和层析柱的纯化;酶免疫斑点法检测表达蛋白的NGFβ抗原活性;Coomassic亮蓝G250法测定表达蛋白的浓度;十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfat-polyarylanide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析检测表达蛋白的分子量,计算表达蛋白占总蛋白的比率;鸡胚背根神经节突起生长实验和小鼠嗜铬瘤细胞(mouse adrenal pheochromocytoma cells,PC12)无血清培养生长刺激5溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyurididne,Brdu)掺入实验观察真核表达蛋白的生物学活性.结果:转导的3T3细胞具有13.6kd的表达蛋白,每升细胞培养基中可以获得400～500μg NGFβ蛋白,表达蛋白纯度可达95.4%以上.表达蛋白具有很强的NGF抗原活性.鸡胚背根神经节突起生长实验显示真核表达的NGFβ在10ng/ml时有明显的促进突起生长作用,PC12细胞的Brdu掺入实验显示当NGFβ的使用量达10ng/ml时达到最大的平台期,生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×108BU(生物活性单位)/g.结论:使用重组腺相关病毒转导NIH3T3细胞可建立长期表达人NGFβ的NIH3T3细胞株,并表达出具有活性的NGFβ蛋白.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王全颖		62	151	5.0	8.0
2	杨广笑		67	148	5.0	7.0
3	马巍	西安交通大学第一医院骨科	60	322	9.0	16.0
4	刘淼	西安交通大学第一医院骨科	100	812	15.0	23.0