大鼠胎脑神经干细胞HPRT基因的敲除

• 作者: John R Morrison 扈廷茂 李雪玲
• 来源期刊: 遗传学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 大鼠胎脑神经干细胞 基因敲除 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
• 年，卷（期）: 2004,（1）
• 所属期刊栏目: 动物遗传学
• 页码范围: 51-56
• 页数: 6页
• 分类号: Q953
• 字数: 3988字
• 语种: 中文

摘要

根据已知大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase,HPRT)基因的外显子序列,从大鼠HPRT基因组DNA序列的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的3.0 kb的5′长臂(Long Arm,LA)和1.7 kb的3′短臂(Short Arm,SA),并分别克隆到pSL1180和pCR2.1中.进一步构建大鼠HPRT基因打靶载体--pKO-HPRT,经酶切鉴定后的大鼠HPRT基因敲除载体用NotⅠ酶切使其线性化,经溴乙锭、正丁醇、酚、酚/氯仿提纯后,将终浓度调至1 μg/μl.在FuGene-6转染试剂的作用下转染培养24 h的第二代大鼠胎脑神经干细胞(Rat Fetal Neural Stem Cells,rFNSCs).转染后的细胞用80 μg/ml G418和0.2 μmol/L的Ganc全培养液筛选,2 w后将存活细胞进行悬浮培养,使细胞形成球形物,挑选单个的球形物进行单克隆增殖,其中一部分细胞(约2～3×103)用裂解液处理,取上清用于PCR检测,大部分细胞(5×107)用于DNA和RNA的提取,进行Southern bolt和RT-PCR检测,剩余细胞冷冻保存.最后1次实验共分离培养了32个rFNSCs单克隆,其中3个单克隆(9.3%)经PCR、Southern bolt和RT-PCR证实HPRT基因已被敲除.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	扈廷茂	内蒙古大学生命科学学院	49	330	10.0	16.0
2	李雪玲	内蒙古大学生命科学学院	13	24	3.0	4.0