自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

• 作者: 刘翠萍 刘超 张寄南 张建桥 杜青 王亚冬 袁南荣 郑肇巽 马宏泰 黄鹏
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 移植,自体 角膜缘/细胞学 干细胞/移植 羊膜/细胞学
• 年，卷（期）: 2005,（46）
• 所属期刊栏目: 组织构建研究
• 页码范围: 65-68
• 页数: 5页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6957字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2005.46.036

摘要

目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性.方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成.选用新西兰白兔15只,雌雄不拘.用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼.另一只眼为供体眼.15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组.②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3 mm3,体外培养.对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察.在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织.倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达.透射电镜观察超微结构.5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术.羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组.③移植实验后7,10,20,30 d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相.并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察.结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48 h细胞贴壁,15 d左右形成单层.传代培养次日细胞贴壁,10 d形成良好的单层.细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致.②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐.AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性.③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接.扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构.④羊膜上接种细胞的生长特征:24 h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层.气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长.⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片.组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层.透射电镜可见桥粒样结构.⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整.基质内有炎性细胞和红细胞浸润.供体角膜未出现临床病理性损伤.羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失.基质内有炎性细胞和红细胞浸润.对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润.结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代.②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似.③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症.