短发夹RNA对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

• 作者: 刘旭阳 孙葆忱 蔡春梅
• 来源期刊: 中华眼科杂志
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 血管内皮生长因子A 色素上皮细胞,眼
• 年，卷（期）: 2006,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 334-337
• 页数: 4页
• 分类号: R77
• 字数: 3004字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j:issn:0412-4081.2006.04.012

摘要

目的探讨针对人血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹RNA(shRNA)在体外对视网膜色素上皮(RPE)细胞VEGF表达的影响. 方法用酶辅助显微分离法分离人RPE细胞,并用细胞角蛋白和S-100进行免疫组化鉴定.设计针对人VEGF的短发夹RNA(shRNAs,P1,P2), P3为阴性对照即不含特异性shRNA,P1、P2退火后双链DNA连接到质粒pSilencer 4.1-CMV的BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切位点.转化细菌后,提取的质粒用EcoRⅠ和 SamⅠ进行酶切鉴定.实验分5组,第1组:RPE细胞中在含有100 μmol/L CoCl2,10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养30 h;第2组:在常规含有10% FBS的DMEM培养基中培养30 h;第3、4、5组:分别P1、P2、P3转染细胞24 h后在含有100 μmol/L CoCl2 的10% FBS的DMEM培养基中培养30 h;用免疫印迹法检测各组细胞VEGF表达水平. 结果培养的细胞用细胞角蛋白和S-100免疫组化染色阳性.提取的质粒经酶切后片断相对分子质量分别为3300 和1600,说明质粒成功地提取和纯化.VEGF表达水平1组明显高于2、3、4组(均P<0.001).乏氧(2组与1组比)可以明显增加RPE细胞中VEGF的表达.3、4组(P1和P2)对VEGF表达抑制分别为65.9% 和 52.4%.5组与1组比差异无统计学意义(P=0.147).各组间β肌动蛋白表达量差异无统计学意义.结论针对人VEGF的特异性shRNA可以明显降低人RPE细胞VEGF的表达,为RNA干扰治疗新生血管性眼病,尤其是脉络膜新生血管奠定了基础.