构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

• 作者: 侯俊 孙颖 游绍莉 胡燕 貌盼勇 赵军 赵擎 辛绍杰
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 端粒,末端转移酶 发光蛋白质类 质粒
• 年，卷（期）: 2006,（45）
• 所属期刊栏目: 干细胞研究
• 页码范围: 47-50,插3
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 6653字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2006.45.018

摘要

目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法.方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成.①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因.②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定.③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况.结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750 bp处显示特异性目的条带.②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符.③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内.结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性.两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察.②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础.