构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

• 作者: 李兵仓 王建忠 陈志强 陈菁
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒科 载体蛋白质类 受体,血管内皮生长因子 基因疗法 内皮生长因子
• 年，卷（期）: 2006,（25）
• 所属期刊栏目: 组织工程研究
• 页码范围: 63-65,插图25-3
• 页数: 4页
• 分类号: R329
• 字数: 5215字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2006.25.029

摘要

目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121 cDNA的腺病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性.方法:实验于2003-05/2004-02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室(创伤烧伤复合伤国家重点实验室)完成.穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠.pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠.BamHⅠ,XbaⅠ,NcoⅠ DNA限制性内切酶均购自Takara公司;鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司;用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121 cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中,与腺病毒质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共同转染293细胞并反复扩增,构建携带目的基因的重组腺病毒,并进行滴度测定.用重组腺病毒感染NTH3T3细胞,用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达.结果:①重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定:重组质粒经XbaⅠ和NcoⅠ酶切后,得到酶切片段长度为651 bp的正向连接重组质粒.测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确.②Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定:pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdeltaE1,3Cre质粒共转染293细胞后7 d,部分293细胞出现CPE,10 d后出现CPE的细胞明显增多,约2周时绝大多数细胞出现CPE,而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象.最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1.0×1010～4.3×1011PFU/mL.③血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达:重组腺病毒转染NIH3T3细胞48 h后行细胞免疫组织化学染色,结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性,阳性染色主要位于细胞浆中,而未转染病毒的细胞染色极弱.结论:构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李兵仓	解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室	8	40	3.0	6.0
2	王建忠	解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室	6	22	3.0	4.0
3	陈菁	解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室	3	5	1.0	2.0
4	陈志强	解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室	8	152	3.0	8.0