人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定

• 作者: 侯云德 吕宏亮 吴斌文 张成海 李武平 林菊生 段招军 王家駹 衣作安 陈勇
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 角蛋白细胞 色谱法,离子交换 色谱法,亲和 生长物质 基因表达
• 年，卷（期）: 2006,（45）
• 所属期刊栏目: 组织工程研究
• 页码范围: 197-200
• 页数: 4页
• 分类号: R3
• 字数: 2180字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2006.45.033

摘要

背景:人角质化细胞生长因子2具有广泛的生理功能,在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用.目的:克隆人角质化细胞生长因子2基因,于大肠杆菌中表达,并检测其生物学活性,为进一步开发提供实验依据.设计:开放性实验.单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所.材料:实验于2000-09/2002-05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成.pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶(Promega公司);人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物(上海博亚生物技术有限公司合成);肝素-Sepharose CL-6B (Pharmacia公司);快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒(GIBCO公司);质粒DNA快速提取试剂盒(博大公司);BL-21-codon plus compent cells (Stratagene公司).方法:用高表达菌株BL-21-codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性.通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2 cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒.在大肠杆菌BL-21-eodon plus compent cells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白.采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性.主要观察指标:人角质化细胞生长因子2 cDNA的片段长度和序列,人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达,纯化人角质化细胞生长因子2的活性.结果:人角质化细胞生长因子2 cDNA片段大小约500 bp,人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达,于上清中可溶性表达,SDS-PAGE显示相对分子质量约20 000;人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性,1,5,10/L人角质化细胞生长因子2 A值(490 nm)高于空白对照组,差异有非常显著性意义(分别为0.174±0.022,0.220±0.029,0.306±0.050,0.066±0.004,P＜0.001).结论:成功克隆人角质化细胞生长因子2基因,并于大肠杆菌BL-21中得到高效表达;纯化的人角质化细胞生长因子2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性.