通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

• 作者: 侯瑾 施典羽 朱宏亮 杨广笑 王全颖 祝康 郑国玺 韦俊荣
• 来源期刊: 西安交通大学学报（医学版）
• 关键词: 重组腺伴随病毒 载体 报告基因 基因治疗 NIH3T3
• 年，卷（期）: 2007,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 14-17
• 页数: 4页
• 分类号: Q812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8259.2007.01.004

摘要

目的 构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用.方法 使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV.在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV.应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达.结果 重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011 cfu/mL,浓缩后可达2×1013 cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体.插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV.感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光.结论 构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础.