Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

• 作者: 于美娟 尚延昌 张成 李美山 熊符 王淑辉 肖少波
• 来源期刊: 生物工程学报
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒载体 Microdystrophin Mdx鼠间充质干细胞 DMD
• 年，卷（期）: 2007,（1）
• 所属期刊栏目: 基因工程
• 页码范围: 27-32
• 页数: 6页
• 分类号: R730.5
• 字数: 5489字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2007.01.005

摘要

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础.用Not Ⅰ酶切合microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因.片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO.PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达.成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×1012 vp/mL.间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达.该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础.