重组腺病毒对体外培养耳蜗Corti器的转染特性

• 作者: 丁大连 杜宝东 杜波 王苹
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 内耳 重组腺病毒 基因转染 组织工程 细胞工程
• 年，卷（期）: 2007,（42）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 8453-8456
• 页数: 4页
• 分类号: R329.2
• 字数: 5120字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.42.029

摘要

目的:腺病毒载体是在内耳基因治疗的实验研究中应用最广泛的载体之一,但载体的靶向性不明显.通过重组腺病毒携带报告基因EGFP转染体外培养耳蜗器官,观察各型细胞的转染特性.方法:实验于2004-08/2006-01在美国纽约州立大学布法罗分校听力耳聋研究中心完成.①实验材料:Fisher大鼠来源于布法罗大学的实验动物中心.AdV/EGFP是Buffalo大学Dr.Lee惠赠.②实验方法:选取出生3 d的大鼠分离获取耳蜗组织.使用携带报告基因-EGFP的重组腺病毒(AdV/EGFP),以1×107,1×108,1×109,2×109V P/mL 作用耳蜗,于感染后6,12,24,48 h和3 d,固定组织,观察感染特性.分离出生3 d的大鼠耳蜗Corti器,基底膜分离后,立即进入2 mL滴度为1×109VP/mL,含2mmol/L 的庆大霉素病毒溶液,作用3 h后平铺到胶粒上,加入含2 mmol/L庆大霉素的生长培养基,作用24 h后收获样品.③实验评估:采用TRITC-labeled phaloidin组织化学染色,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP和TRIC在耳蜗细胞中的表达定位.结果:①重组腺病毒可转染离体培养耳蜗组织中的各种类型细胞,外沟细胞感染率最高,其次为齿间细胞.仅有很少部分的毛细胞和螺旋神经元被感染.②在病毒滴度在107～109 VP/mL 的范围内,重组腺病毒感染耳蜗具有剂量依赖性,但大于这个滴度并不会增加感染效率,而且高浓度的重组病毒可造成毛细胞和外沟细胞破坏.③EGFP最早于感染后6 h出现,48 h达到高峰,外源基因高表达至少可维持7 d.④庆大霉素损伤所有的毛细胞后,重组腺病毒能够感染多数的Deiters'细胞,齿间细胞的感染效率高于腺病毒对正常耳蜗组织的感染.结论:重组腺病毒转染效率在耳蜗各种类型细胞明显不同,重组腺病毒优先感染耳蜗支持细胞.