应用Ⅳ型胶原黏附法进行人表皮干细胞的体外快速分离与鉴定

• 作者: 余于荣 曾元临 李国辉 罗旭 辛国华 邱泽亮
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 细胞分离 细胞培养 体外 表皮干细胞
• 年，卷（期）: 2007,（20）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 3861-3863
• 页数: 3页
• 分类号: R394.2
• 字数: 3750字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.20.006

摘要

目的:以Ⅳ型胶原黏附法体外快速分离人表皮干细胞,利用其特异性标记物β1整合素及角蛋白19鉴定所培养细胞是否为表皮干细胞.方法:实验于2004-05/2005-03在南昌大学医学院烧伤研究所完成.①包皮来自行包皮环切术的儿童,由南昌大学第一附属医院提供,患者及其家属均签署知情同意书.②取手术刚切下的新鲜包皮,剔除皮下组织,采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞.收集处于对数生长期的第2～3代成纤维细胞的上清液,过滤除菌后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,再加入体积分数为0.1的胎牛血清、表皮生长因子5μg/L、氢化可的松400μg/L、氯化钙0.05 mmol/L-谷氨酰胺0.1 mol/t.、牛垂体提取物1.0 mg,L,组成表皮于细胞培养液.分离的表皮片浸入2.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/L乙二胺四乙酸消化液中5 min,所得细胞以表皮干细胞培养液悬浮.③将获得的角朊细胞悬液接种于预铺Ⅳ型胶原的六孔板中,每孔接种约1.5 mL.,室温静置10 min,吸除未贴壁细胞,磷酸盐缓冲液漂洗至无细胞悬浮,即为富集分离的人表皮干细胞.加入人表皮干细胞培养基常规培养,第3天换液,后每隔1 d换液一次.以同一标本同一批次培养的角朊细胞作为对照.④通过检测β,整合素、角蛋白19的表达水平及其克隆形成率和克隆维持时间,对其进行鉴定,以角朊细胞作为对照.结果:①人表皮干细胞形态学观察:倒置显微镜下,从角朊细胞中分离出的表皮干细胞体积小,呈单个、圆形贴壁,分散生长;培养12 d后呈克隆样生长.②人表皮干细胞的克隆形成率:与同一标本同一批次培养的角朊细胞比较,人表皮干细胞的克隆形成率高[(8.72±0.73)%,(17.04+1.01)%,P＜0.01],克隆维持时间更长[(9～10)d,(15～18)d,P＜0.01].③人表皮于细胞β1,整合素和角蛋白19的表达:β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性.结论:①应用Ⅳ型胶原黏附法可对人表皮干细胞进行体外快速分离.②结合细胞形态学、细胞高克隆形成率和特异性标记物阳性表达等多种手段,鉴定所培养细胞为表皮干细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	曾元临	南昌大学第一附属医院烧伤科	74	228	8.0	10.0
2	辛国华	南昌大学第一附属医院烧伤科	67	237	9.0	11.0
3	李国辉	南昌大学第一附属医院烧伤科	58	279	9.0	13.0
4	罗旭	温洲医学院第一附属医院烧伤科	1	1	1.0	1.0
5	余于荣	南昌大学第一附属医院烧伤科	4	17	2.0	4.0