骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较

• 作者: 孙晓红 杨慧 段春礼 赵春礼 赵焕英 鲁玲玲
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 间质干细胞 骨髓细胞 基因表达 转染 腺病毒科
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 骨髓间充质干细胞生物学特征
• 页码范围: 471-474,后插页2
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 6701字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.03.022

摘要

目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法.方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成.①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率.②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞.转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增.③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率.结果:①脂质体介导的基因转染24 h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%.抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆.②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白.当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活.继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白.③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%.但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%.结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因.3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率最低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率最高,最适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯化和扩增,其可能更适合于体内基因直接感染.