犬骨髓单个核细胞诱导分化为平滑肌样细胞

• 作者: 刘爽 孙海辰 崔叶青 张建 张景艳 张淑文 李建新 汪忠镐 谷涌泉 陈兵 陈晓松
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 组织丁程器官构建 骨髓单个核细胞 平滑肌样细胞 种子细胞
• 年，卷（期）: 2007,（20）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 3876-3881
• 页数: 6页
• 分类号: R381
• 字数: 7596字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.20.005

摘要

目的:探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化为平滑肌样细胞的可行性,为构建组织工程器官提供种子细胞.方法:实验于2005-10/2006-12在教育部重点实验室,实验室等级1级的首都医科大学宣武医院外科实验室完成.实验材料:体质量20～30 kg成年雌性杂种犬6只,由北京市科宇实验动物养殖中心提供(许可证号为SCXK(京)2000-0015),动物饲养级别1级.实验方法:①骨髓单个核细胞的分离培养:穿刺健康成年实验犬髂前上棘,抽取骨髓10mL,加入肝素抗凝,以等体积PBS充分混匀,4℃条件下转入离心管中,取20 mL淋巴细胞分离液,将稀释骨髓按1:1小心加在分离液的界面上,用水平离心机以1 500 r/min离心10 min后,单个核细胞位于血浆和离心液界面层.吸取界面层单个核细胞层,以含体积分数为0.1胎牛血清的PBS冲洗3次,备用.②骨髓单个核细胞诱导分化为平滑肌样细胞:将收获的犬骨髓单个核细胞以由含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM/F12混合培养液、0.5μg/L内皮细胞生长因子、2μg/L碱性成纤维生长因子、10μg/L血小板源性生长因子BB、100μg/L胰岛素样生长因子、1 mmol/L磷酸维生素C、0.04 mmol/L脯氨酸组成的诱导培养基重悬,以1×109L.种植于胶原铺底的培养瓶中,置37℃、含50 mL/L CO2饱和湿度培养箱中,进行诱导培养.倒置相差显微镜下观察细胞形态特征.在诱导培养后第1,3,5,7,9,11天绘制细胞生长曲线.采用免疫组织化学方法进行细胞表型鉴定,并评价细胞生长增殖情况.结果:①骨髓单个核细胞向平滑肌样细胞诱导的细胞生长曲线:接种第1,3,5,7,9,11天计数每孔细胞数分别为(2.73±0.18)×108,(3.17±0.36)×108,(7.35±1.28)×108,(23.61±1.56)×108,(53.48±3.47)×108,(48.51±5.36)×108L-1②免疫组织化学方法鉴定细胞表型:原代细胞仅少数α-平滑肌肌动蛋白染色明显阳性,明显阳性细胞约占总数的(60.5±5.g)%,细胞内肌丝样结构不明显,而平滑肌肌球蛋白重链、碱性钙调宁蛋白染色阴性;P3代细胞生长5 d,细胞生长汇合后,绝大部分诱导后细胞α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、碱性钙调宁蛋白染色阳性,可见胞浆内清晰的肌丝样结构,明显阳性细胞分别占细胞总数的(86.2±13.5)%,(78.7±10.2)%,(76.63±13.8)%,明显高于原代细胞(P＜0.05).③平滑肌样细胞的亚型分析:原代细胞爬片标本Flk-1染色多数呈阳性,第3代细胞Flk-1染色几乎阴性,阳性细胞胞膜、胞浆着色呈棕黄色.原代及传代细胞Vimentin染色均呈阳性,阳性细胞胞浆着棕黄色.本组细胞Desmin染色阴性.结论:骨髓单个核细胞可以被定向诱导成为平滑肌样细胞,能够满足组织工程种子细胞的要求.