脐血单个核细胞成功培养的相关影响因素

• 作者: 侯萍 刘英杰 宋志国 李剑平 赵冬阳
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 脐血 干细胞 影响因素
• 年，卷（期）: 2007,（37）
• 所属期刊栏目: 干细胞实验技术方法
• 页码范围: 7377-7380
• 页数: 4页
• 分类号: R394.2
• 字数: 4951字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.37.017

摘要

目的:脐血来源丰富且免疫原性低,移植后排斥反应低的特性决定其具有临床应用的可行性.实验拟验证脐血单个核细胞数量与孕妇年龄条件、脐血量及制备因素的相关性,并证实其在体外培养的最佳条件.方法:实验于2006-03/2007-01在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.①实验材料:300份脐血均来源于足月分娩的健康孕妇,全部签署知情同意书.孕妇年龄20～35岁,其中≤25岁36例,＞25岁264例;脐血采集量15～130 mL,其中＜33 mL 18例,≥33 mL 282例;采集到制备时间差为2～24 h,其中＞12 h 30例,≤12 h 270例.红细胞裂解液由本实验室自制,主要成分为高渗盐水和三蒸水.②实验方法:人脐血用枸橼酸钠抗凝,采用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞,锥虫蓝染色结果表明活细胞比率达95%～100%.将脐血单个核细胞分别按1×106,5×106,1×107的密度接种,以未加细胞因子作为对照组,在无血清DMEM/F12培养液中加入20 μg/L神经生长因子和2%神经营养因子B27作为扩增诱导组,于培养后的1,3,7 d进行换液,培养周期选择5 d、7～10 d和15 d.③实验评估:分别对脐血单个核细胞数与孕妇年龄、脐血采集量、采集到制备时间差的相关性进行分析.倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞因子作用及最佳的种植密度、首次换液时间、培养周期.观察使用红细胞裂解液后对脐血单个核细胞增殖和分化的影响.结果:①脐血细胞的生长及形态特征:脐血单个核细胞刚接种时为散在的圆形细胞,2 d贴壁,为散在的单个或数个细胞,呈长梭形,形态均一.3 d左右细胞突起增加,细胞数量增多.随着培养时间的延长,可见多个细胞之间形成网络,诱导后出现神经样细胞形态.②脐血单个核细胞数的影响因素:脐血单个核细胞数与孕妇年龄不相关(r＜0.3),与脐血量、采集到制备时间差均具有相关性(r＞0.8).③脐血单个核细胞培养影响因素:种植密度为5×106 L-1、首次换液时间在3 d左右、培养周期为7～10 d的细胞生长状态较好.扩增诱导组脐血单个核细胞增殖和分化状态好于对照组.④红细胞对脐血单个核细胞生长分化的影响:红细胞裂解的最佳时间为45～50 s,并发现红细胞对脐血单个核细胞的生长有一定程度影响,且破骨细胞较多.红细胞裂解后的脐血单个核细胞增殖分化较好,细胞形态较为均一.结论:①采集量为33 mL、且采集到制备的时间差为12 h的脐血制备单个核细胞数量超过1×108的成功例数较高.②5×106 L-1接种密度、首次换液时间为3 d、培养周期7～10 d的脐血单个核细胞生长状态较好,神经细胞生长因子可促进其增殖分化.③红细胞裂解后脐血单个核细胞增殖分化更好,破骨细胞较少.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	宋志国	中国医科大学药理学教研室	16	135	7.0	11.0
2	刘英杰	深圳市北科生物工程研究所细胞实验室	1	1	1.0	1.0