人骨形成蛋白2和血管内皮细胞生长因子165在人骨髓间充质干细胞中的共表达

• 作者: 吴国平 归来 杨锴 滕利 郭力
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 骨形态发生蛋白质类 受体,血管内皮生长因子 基因 治疗学 骨髓 干细胞
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 骨髓间充质干细胞生物学特征
• 页码范围: 587-591
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 2214字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.03.028

摘要

背景:骨形成蛋白与骨、软骨、肌腱、韧带等多种组织的形成有关,血管内皮细胞生长因子通过提高血管的通透性和促进内皮细胞迁移可促进血管生成.目的:构建人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165的真核共表达载体,并观察其在骨髓间充质干细胞中的表达.设计:观察对比实验.单位:泸州医学院附属医院整形外科和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院.材料:骨髓间充质干细胞来源于健康成人献髓志愿者.pIRES-EGFP-hVEGF165含人血管内皮细胞生长因子165全长cDNA序列,由中国医学科学院整形外科医院成挺博士提供.含人全长骨形成蛋白2cDNA序列的克隆载体pSP65-hBMP2,由军事医学科学院基础医学研究所郭希民博士提供.真核表达载体pIRESneo(Clontech公司)Pyrobest DNA Polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶和质粒提取试剂盒、DNA片段分离及纯化试剂盒(大连宝生物公司),LipofectamineTM脂质体转染试剂盒、DMEM培养基、胰蛋白酶、TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco BRL),Omniscript RT试剂盒(Qiagen),Taqplus-DNA聚合酶(Promega),PMSF、leupeptin、aprotinin、chymostatin(Sigma),蛋白酶抑制剂、PVDF膜(Amersham-Pharmacia Biotech),兔抗人BMP2和VEGF单克隆抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔IgG-过氧化物酶(博士德公司),G418(美国Ameresco公司).方法:实验于2005-06/2006-04在泸州医学院附属医院和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院完成.利用重组DNA和基因克隆技术将人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165cDNA定向克隆到载体pIRESneo的多克隆位点构建重组质粒,经Xho Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切和基因测序鉴定后,在阳离子脂质体介导下转染骨髓间充质干细胞,根据观察结果的需要,将转染的细胞分为IRES-hBMP2-VEGF165组,pIRES-hBMP2组,pIRES-VEGF165组,空质粒对照组,分别给予pIRES-hBMP2-VEGF165,pIRES-hBMP2,pIRES-VEGF165 及pIRES-neo转染,取同样数量的未转染的细胞作为空白对照组.通过RT-PCR及Western blot检测细胞骨形成蛋白2和血管内皮细胞生长因子165mRNA表达和蛋白的分泌.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②RT-PCR观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人骨形成蛋白2 mRNA和人血管内皮细胞生长因子mRNA表达.③Western Blot检测质粒转染后的骨髓间充质干细胞的骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子蛋白分泌情况.结果:①重组质粒双酶切和基因测序分析结果:用EcoRI和Bgl Ⅱ将三个阳性质粒和pIRES-BMP2进行双酶切鉴定与基因测序分析重组质粒的hBMP-2和hVEGF165与报道结果一致,证明重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165构建成功.②RT-PCR检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165的细胞高表达BMP2 mRNA和VEGFmRNA,而未转染的细胞和只转染空质粒的细胞则阴性或只有痕量表达.③Westem Blot检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-BMP2的细胞大量分泌人BMP2至上清,而转染pIRES-VEGF165或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的BMP2分泌;转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-hVEGF165的细胞大量分泌血管内皮细胞生长因子至上清,而转染pIRES-hBMP2或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的血管内皮细胞生长因子分泌.结论:重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165真核共表达载体在人骨髓间充质干细胞细胞中有良好的表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	归来		109	643	12.0	18.0
2	滕利		59	393	10.0	16.0
3	吴国平	泸州医学院附属医院整形外科	27	125	6.0	9.0
4	郭力	泸州医学院附属医院整形外科	85	428	12.0	15.0
5	杨锴		3	46	3.0	3.0