体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法:差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法

• 作者: 李世普 殷义霞 王欣宇 袁琳 闫玉华
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 细胞培养技术/方法 嗅球/细胞学 免疫组织化学
• 年，卷（期）: 2007,（7）
• 所属期刊栏目: 研究快报
• 页码范围: 1284-1286
• 页数: 3页
• 分类号: R3
• 字数: 2666字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.07.031

摘要

目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法.方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成.①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德).②选取出生3 d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的最外两层,通过1.25 g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养.③采用Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法纯化嗅鞘细胞.培养18 h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36 h,重复上述步骤移人0.1 g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24 h内陆续贴壁,常规培养2 d,加入终浓度为2 mg/L的阿糖胞苷,作用48 h后,换上新的培养基,继续培养1 d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25 g/L的胰酶消化10 min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液.④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率.结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织.②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁.③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%.④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%.结论:实验所采用的Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	袁琳	武汉理工大学生物材料与工程研究中心	21	188	8.0	13.0
2	闫玉华	武汉理工大学生物材料与工程研究中心	136	1901	24.0	37.0
3	李世普	武汉理工大学生物材料与工程研究中心	188	2142	24.0	37.0
4	殷义霞	武汉理工大学生物材料与工程研究中心	21	52	4.0	5.0
5	王欣宇	武汉理工大学生物材料与工程研究中心	35	437	11.0	20.0