家蝇泛素编码区cDNA序列的克隆及在原核细胞中的表达

• 作者: 任顺祥 张文庆 许小霞 金丰良
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 家蝇 泛素 克隆 原核表达 抗血清
• 年，卷（期）: 2008,（5）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 473-479
• 页数: 7页
• 分类号: Q966
• 字数: 5629字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0454-6296.2008.05.003

摘要

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用.本研究根据GenBank已登录的真核生物泛素(ubiquitin)编码框的氨基酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR克隆了家蝇Musca domestica泛素基因的编码区cDNA序列,并进行了测序.序列分析表明,该编码区的长度为228 bp,编码76个氨基酸,命名为Mdubi,GenBank登录号为DQ115796.同源性比较发现,Mdubi氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达94%以上.RT-PCR检测表明,Mdubi在家蝇不同组织中均高效表达,且不受大肠杆菌Escherichia coli刺激的影响,是遍在性表达.为进一步研究Mdubi的结构和功能,将Mdubi克隆到原核表达载体pQE30上,构建重组质粒pQE30-UBI,转化大肠杆菌M15感受态细胞,在IPTG诱导下进行了高效表达,SDS-PAGE检测表明Mdubi在大肠杆菌中可表达相对分子质量为9.6 kD的可溶性融合蛋白;Western blot分析表明表达产物能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明表达的Mdubi为N端带有6His标签的融合蛋白.利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了Mdubi,以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗Mdubi血清.本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列,并在原核细胞中得到了表达,为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础.