短发夹RNA干扰c-myc重组腺病毒的构建

• 作者: 刘淼 张银刚 王栋琪 王民
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒科 RNA干扰 基因沉默 组织构建
• 年，卷（期）: 2008,（33）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 6442-6446
• 页数: 5页
• 分类号: R649.65
• 字数: 5578字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.33.010

摘要

背景:RNA干扰已被多次证实足一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段.目的:以短发卡RNA腺病毒表达载体为介导,构建介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成.材料:人骨肉瘤细胞系OS-9901由解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所范清宇教授惠赠.方法:设计有短发夹RNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,通过反转录-聚合酶链反应方法筛选对c-myc沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒.主要观察指标:①观察细胞病变效应.②通过50%组织培养感染剂量测定病毒滴度.结果:电泳验证后的dsoligo插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组后成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒.3 d开始出现细胞病变效心,6d更加明显,测定证实病毒滴度为103.8/0.1 mL.结论:成功构建介导shRNA.c-myc复制缺陷型重组腺病毒.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘淼	西安交通大学医学院第一附属医院骨科	100	812	15.0	23.0
2	王民	西安交通大学医学院第一附属医院骨科	62	407	12.0	18.0
3	王栋琪	西安交通大学医学院第一附属医院骨科	23	150	7.0	12.0
4	张银刚	西安交通大学医学院第一附属医院骨科	87	662	14.0	21.0