重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

• 作者: 余鹏博 党晓谦 时志斌 杨佩 王坤正 黄向辉
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 骨髓基质干细胞 血管内皮生长因子 腺相关病毒 绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2008,（21）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 4097-4101
• 页数: 5页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6879字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.21.017

摘要

背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王坤正	西安交通大学第二附属医院骨科	404	3247	26.0	38.0
2	党晓谦	西安交通大学第二附属医院骨科	152	970	15.0	23.0
3	时志斌	西安交通大学第二附属医院骨科	86	835	15.0	26.0
4	余鹏博	陕西省疾病预防控制中心病毒室	38	213	7.0	13.0
5	杨佩	西安交通大学第二附属医院骨科	57	215	8.0	11.0
6	黄向辉	西安交通大学第二附属医院骨科	8	48	5.0	6.0