海南坡鹿外周血白细胞cDNA文库的构建

• 作者: 刘涛 吴科榜 成鹰 李治深 杜丽 林贤梅 满初日嘎 王凤阳 申明霞 祁超 符运南 许世英
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 海南坡鹿 外周血白细胞 cDNA文库 SNART技术
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 5-8
• 页数: 4页
• 分类号: Q785
• 字数: 3861字
• 语种: 中文

摘要

目的:构建海南坡鹿外周血白细胞eDNA文库.方法:采用RNAiso Reagent (TAKARA)处理新鲜血液,以总BNA抽提试剂盒(上海华舜)制备总RNA.利用SMART(Switching Mechanism at 5'end of RNA Transcript)技术,用PaWerscriptTM反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PeR扩增获得cDNA双链,Sfi I酶切和CHROMA APIN-400TM柱分级分离后,500bp以上的片段与pDNRLIB载体连接,电转化入E.coli DG5a,建成原始文库.然后扩增文库并随机挑取单菌落,酶切鉴定重组子插入片段大小.结果:经鉴定,库容量达到1.9×106克隆,原始文库滴度为1.59×1010cfu/mL,重组率接近100%,扩增后的文库滴度为7.4×1012cfi/mL.插入片段大小分布为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb.结论:所构建文库的各项指标均达到要求,为筛选海南坡鹿已知和未知功能基因提供了材料来源,且为进一步研究基因的结构和功能奠定了重要基础.