携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达

• 作者: 何援利 马颖
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 抗血管生成基因治疗 内皮抑素 腺病毒 人脐静脉内皮细胞 组织构建
• 年，卷（期）: 2008,（7）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 1268-1271
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 3850字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.07.022

摘要

目的:内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子,但内皮抑素蛋白极不稳定,难以制备及应用,故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用.实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白.方法:实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成.以Pshuttle-Endostatin质粒为模板,应用特异引物,通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断,经测序鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组质粒经筛选、提取、纯化后,经酶切及测序鉴定正确,再大量扩增为腺病毒载体,线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增,得到的病毒液纯化扩增后,感染人脐静脉内皮细胞,反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达,蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达.结果:获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确,重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确,成功转染AAV293细胞,包装并扩增出病毒液,纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL,进一步感染人脐静脉内皮细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达.结论:人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功,且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	何援利	南方医科大学珠江医院妇产科	173	1264	19.0	26.0
2	马颖	南方医科大学珠江医院妇产科	32	66	4.0	5.0