RNA干扰技术阻断α-synuclein基因过表达诱导的α-synuclein蛋白病理性积聚的研究

• 作者: 严新翔 唐北沙 廖小平 张玉虎 文国强 曹立 李静 欧阳锋 郭纪锋 陈涛 龙志刚
• 来源期刊: 中华医学遗传学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 α-synuclein基因 蛋白积聚 帕金森病
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 128-131
• 页数: 4页
• 分类号: R3
• 字数: 4012字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1003-9406.2008.02.002

摘要

目的 构建并筛选针对帕金森病致病基因α-synuclein特异、高效的RNA干扰载体,观察应用RNA干扰技术阻断α-synuclein过表达导致α-synuclein蛋白病理性积聚的作用.方法 采用携带H1启动子的PBSHH1质粒,设计并构建针对α-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性α-synuclein基因干扰载体pSYNi-1、pSYNi-2、pSYNi-3、pSYNi-4,通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后,转染HEK293细胞,应用Western印迹、逆转录-PER观察干扰载体的有效性,筛选特异、高效的RNA干扰载体.采用脂质2000将筛选的最佳α-synuelein-pBSHH1 RNA 干扰载体及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体共转染HEK293细胞,并设立对照组,48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染色观察细胞质内嗜酸性小体的形成.结果 Western印迹、逆转录-PER结果显示,pSYNi-1载体具有高效的RNA干扰抑制作用,效率达69.6%;将α-synuclein-pBSHH1 RNA干扰载体pSYNi-1及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞,48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488 nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚,而转染pSYNi-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀;免疫荧光细胞化学检测结果显示,转染48h后对照组可见α-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集,转入RNA干扰载体psYNi-1后胞浆内α-synuclein免疫阳性产物分布均匀;HE结果显示,转染48h后,对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成;转入RNA干扰载体pSYNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成.结论 RNA干扰技术通过抑制α-synuclein基因的表达,成功阻断了野生型α-synuclein过表达所诱导的α-synuelein蛋白病理性积聚,为最终应用RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据.