构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒

• 作者: 周静 张宸豪 张扬 马爱新
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 糖尿病,1型 柯萨奇病毒感染 病毒非结构蛋白质类 组织构建
• 年，卷（期）: 2008,（24）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 4713-4717
• 页数: 5页
• 分类号: R587.1
• 字数: 5976字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.24.029

摘要

背景:研究表明柯萨奇B4病毒感染与1型糖尿病发病有关,但目前尚未明确其关系的确切机制.目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒,转入大肠杆菌中表达,并对表达产物进行功能鉴定.设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/08在吉林大学免疫学教研窒完成.材料:CVB4、HeLa细胞病毒均为吉林大学病原生物教研室保存;菌株E.coli DH5α与M15为东北师范大学遗传所保存;质粒PUCm-T载体、PQE4.0载体由东北师范大学曾宪录教授惠赠.方法:提取柯萨奇B4病毒总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增非结构蛋白P2C基因,与PUCm-T载体连接,将PUCm-T-P2C质粒进行BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切,同收目的片断并定向克隆到PQE4.0表达载体中酶切鉴定.将PQE4.0-P2C 阳性重组质粒转化大肠杆菌M15,在IPTG诱导下表达.主要观察指标:①以十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C的表达.②采用淋巴细胞转化实验和酶联免疫吸附实验检测大肠杆菌M15细胞重组蛋白粗提物.结果:①反转录-聚合酶链反应扩增得到的987 bp的cDNA片段,克隆入PUCm-T载体,酶切释放出长度约2773 bp和987 bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,序列分析与Genbank 报道的序列一致.目的片段克隆入PQE4.0载体,酶切释放出长度约3 400 bp和987 bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,获得PQE 4.0-P2C重组表达质粒.②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示未诱导组无明显蚩白带,而诱导组在31 000位置均出现较明显的蛋白带,且随着诱导时间延长蛋白表达量也随之增加.③淋巴细胞转化实验与酶联接免疫吸附试验测定结果表明,表达产物具有良好的抗原性与特异性.结论:柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C在大肠杆菌中高效表达,且表达产物具有一定的免疫活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张扬	吉林大学药学院	57	292	9.0	15.0
2	马爱新	吉林医药学院病原教研室	12	45	4.0	6.0