人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

• 作者: 井莹莹 刘铁连 单云波 杨吉成 盛伟华 缪竞成 胡志清 谢宇锋
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 血管生成素1 血管内皮生长因子 腺病毒载体 构建
• 年，卷（期）: 2008,（41）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 8103-8106
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 4245字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.41.032

摘要

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平.方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGFl65,经Pad线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165.结果:PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,Pmel线性化后重组腺病毒载体获得成功包装.脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010 pfu/mL.转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P＜0.05).结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达.