重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察

• 作者: 刘亚伟 刘靖华 姜勇 李红梅 胡水旺 赵明哲 陈腾祥
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: C反应蛋白 载体构建 基因表达 蛋白质复性 HeLa细胞
• 年，卷（期）: 2008,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1155-1160
• 页数: 6页
• 分类号: R730.23|Q344+.13
• 字数: 4102字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2008.06.024

摘要

目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞.方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化,梯度透析复性,并与HeLa细胞孵育,利用荧光显微镜观察其内化入胞.结果:PCR、双酶切和测序鉴定表明,pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确;转化实验发现,该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达;蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明,复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜,孵育一定时间后,可定位于胞质及胞核.结论:成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人CRP原核表达载体,该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP,纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合,并能内化入胞,移位入核.