大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪

• 作者: 姜自林 杨恬 杨珂
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 毛囊干细胞 增强型绿色荧光蛋白 细胞示踪 细胞增殖
• 年，卷（期）: 2008,（8）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 1481-1484
• 页数: 4页
• 分类号: R394.2
• 字数: 4960字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.08.028

摘要

目的:毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力,在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景,但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议.实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法,以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性.方法:实验于2007-05/09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成.①材料:新生7 d龄SPF级SD大鼠5只,由解放军第三军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.pEGFP-N1质粒由本实验室保存.②实验方法:大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊,dispase消化,将毛囊从真皮鞘中挤出,收集形态完好且处于生长期的毛囊,分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊,取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化,向所得细胞悬液中添加含10%胎牛血清DMEM/F12完全FAD培养基,常规培养7 d后,采用IV型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞.待筛选后的细胞生长至70%～80%融合后,进行pEGFP-N1质粒细胞转染.③实验评估:通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达,对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定.转染24～72 h后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力.结果:①细胞形态及超微结构:筛选后的毛囊干细胞形态均一,呈铺路石状,透射电镜显示细胞胞体小,核浆比例大,核仁明显,细胞器发育不成熟,处于原始状态.②细胞表型:高表达CD34和α6-integrin,细胞阳性率≥ 90%.③pEGFP-N1质粒转染及示踪:转染16 h左右细胞出现微弱绿色荧光,经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白.④细胞克隆形成率:与转染前比较,转染后细胞克隆形成率明显降低(t =4.541,P < 0.01).结论:①利用二步酶消化法联合IV型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞.②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞,是较理想的示踪方法,但细胞增殖能力受一定影响.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨恬	解放军第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室	3	21	2.0	3.0
2	杨珂	解放军第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室	2	12	2.0	2.0
3	姜自林	重庆大学生物工程学院	1	10	1.0	1.0