人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定

• 作者: 刘振龙 曾牧 李慎涛 王炜 赵文明 马静
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 地球科学
• 关键词: 骨保护素 热休克蛋白70 融合蛋白 组织构建
• 年，卷（期）: 2008,（15）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2903-2909
• 页数: 7页
• 分类号: P593.22
• 字数: 8443字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.15.029

摘要

目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆入骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性.方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成.采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒.以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护索-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性.结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白.②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带.③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合.④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性.⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性.结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李慎涛	首都医科大学免疫学系	29	94	5.0	8.0
2	赵文明	首都医科大学免疫学系	45	291	11.0	15.0
3	马静	首都医科大学免疫学系	23	74	5.0	8.0
4	王炜	首都医科大学免疫学系	53	243	9.0	12.0
5	曾牧	首都医科大学免疫学系	2	5	1.0	2.0
6	刘振龙	首都医科大学免疫学系	19	121	6.0	10.0