脐带血血清培养体系扩增人骨髓间充质干细胞及其生物学特征

• 作者: 刘利华 周新伏 唐铁钢 张广森 旷文勇 李佳元 符桑 陈绍芳
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 骨髓间充质干细胞 脐带血清 细胞培养 定向分化
• 年，卷（期）: 2008,（21）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 4044-4048
• 页数: 5页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6909字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.21.019

摘要

背景:骨髓内的间充质干细胞含量极少,因此课题立项设计之一即如何得到足够数量的骨髓间充质干细胞,并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应.目的:拟建立脐带血血清培养系统,以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-09/2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供,6例采自正常供者,6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者.方法:无菌条件下抽取未抗凝的脐带血,静置待血凝块完全析出后吸取血清,离心弃沉淀,取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养,临用前56℃水浴灭活30min.抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL/份,采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞,加入含体积分数为0.1脐带血血清的DMEM/F12进行传代培养.传至第3代低温、液氮冻存,4～8周后予以解冻复苏,胰蛋白酶消化传代.取第4代骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色后,加入成骨诱导体系培养14d,碱性磷酸酶染色;加入脂肪诱导体系培养14d,油红O染色.主要观察指标:绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达,骨髓间充质干细胞定向分化情况.结果:骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代,接种后两三天为生长潜伏期,3～5d为对数增殖期,5～7d细胞生长缓慢进入平台期.采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞,冻存前后扩增数量均基本相似(P0.05),细胞存活率均96%,CD29、CD73、CDl05阳性率均90%,CD31、CD34、CD45阳性率均5%,诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均85%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞,且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变.