阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究

• 作者: 孟逊 朱崇日 杨捷琳 袁辰刚 黄应峰
• 来源期刊: 食品科学
• 学科: 生物学
• 关键词: 阪崎肠杆菌 α-葡萄糖苷酶 克隆 原核表达
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 生物工程
• 页码范围: 213-217
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 4289字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1002-6630.2008.02.042

摘要

目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础.方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b(+)表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株.表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定.结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同.构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符.目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%.同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对表达产物进行过酶活性初步检测证重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色.结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b(+)-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨捷琳		33	146	7.0	10.0
2	袁辰刚		13	52	4.0	7.0