大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率

• 作者: 伍卫 周淑娴 张玉玲 薛声能 雷娟
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: Syndecan-1/遗传学 腺病毒载体 基因治疗
• 年，卷（期）: 2008,（42）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 8290-8293
• 页数: 4页
• 分类号: R541
• 字数: 4648字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.42.024

摘要

背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法.同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点.体外连接法又不可避免非特异性的基冈重组及基因突变.目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率.设计、时间及地点:单一样奉实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光撒告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛皋因组研究中心有限公司.方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdcl质粒:用Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ从质粒pCMV.Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1 基因 片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒.用Ⅰ-CeuI+I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞.主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率.结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1 cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ双晦切可回收3 kb的克隆片段和5.1 kb的载体片段;重组腺病毒质粒用Xho Ⅰ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段.②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13 kb的特异性片段:用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011 PFU/mL.③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24 h后所有细胞均表达绿色荧光.结论:成功构建了携带人鼠黏结蛋白聚糖l基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	薛声能	中山大学附属第二医院心血管内科	39	250	7.0	15.0
2	雷娟	中山大学附属第二医院心血管内科	66	370	11.0	17.0
3	周淑娴	中山大学附属第二医院心血管内科	106	528	12.0	18.0
4	伍卫	中山大学附属第二医院心血管内科	128	624	12.0	17.0
5	张玉玲	中山大学附属第二医院心血管内科	50	174	7.0	11.0