人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定

• 作者: 余鹏博 党晓谦 时志斌 杨佩 王坤正 黄向辉
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 血管内皮生长因子 腺相关病毒 绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2008,（29）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 5755-5758
• 页数: 4页
• 分类号: R394.2
• 字数: 1859字
• 语种: 中文

摘要

背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王坤正	西安交通大学第二附属医院骨科	404	3247	26.0	38.0
2	党晓谦	西安交通大学第二附属医院骨科	152	970	15.0	23.0
3	时志斌	西安交通大学第二附属医院骨科	86	835	15.0	26.0
4	余鹏博	陕西省疾病预防控制中心病毒室	38	213	7.0	13.0
5	杨佩	西安交通大学第二附属医院骨科	57	215	8.0	11.0
6	黄向辉	西安交通大学第二附属医院骨科	8	48	5.0	6.0