荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立

• 作者: 罗进 郭晏海
• 来源期刊: 中国卫生检验杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 聚合酶链反应 乙型肝炎病毒 共价闭合环状DNA
• 年，卷（期）: 2008,（7）
• 所属期刊栏目: 临床检验
• 页码范围: 1384-1386
• 页数: 3页
• 分类号: R51
• 字数: 2201字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-8685.2008.07.065

摘要

目的:建立特异、灵敏的荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法.方法:首先用煮沸法提取血清中的HBVDNA,然后用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)消化松弛环状HBV DNA(rcDNA),保留共价闭合环状DNA(cccDNA).设计一条嵌合引物,该引物分为两部分序列,近5'部分为人为设定的序列,近3'部分是与正链缺口下游互补序列.先用该嵌合引物以正链为模板,自HBV cccDNA1590nt开始向上游延伸,然后以嵌合引物中人为设定的序列为下游引物、与负链互补的上游引物以及一条在两引物之间与正链互补的Taqman探针,扩增检测嵌合引物延伸的产物.由于带有缺口的HBV rcDNA无法被嵌合引物延伸,因此最终只能扩增检测到cccDNA.结果:用含有相应HBV DNA片端的PUC19质粒模拟HBV cccDNA,该检测方法的检测灵敏度为1×103拷贝/ml;以模拟松弛环状DNA(rcDNA)与模拟HBV cccDNA按不同比例混合,在rcDNA与cccDNA的比为1×109拷贝/ml:1×103拷贝/ml时,该方法仍可检测到模拟cccDNA;单独检测模拟rcDNA浓度为1 × 109拷贝/ml时,该方法检测未出现假阳性.结论:该检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法操作简单、灵敏、特异.适用于检测血清中HBV cccDNA.