P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建

• 作者: 岳晓珊 赤池敏宏 長岡正人 高欣
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: P19细胞 心肌细胞 心肌分化 钙粘素融合蛋白
• 年，卷（期）: 2008,（12）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2277-2280
• 页数: 4页
• 分类号: R394.2
• 字数: 5170字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.12.032

摘要

目的:如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能?实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型.方法:实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成.①材料:P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供.钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成.②实验方法:P19细胞按1×107 L-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100 nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4 d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d.③实验评估:观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin T的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiac actin、gata-4的表达.结果:①P19细胞经1,5,10 nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞.P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/L N-cad-Fc及10mg/L N-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%.②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白Troponin T呈阳性表达.③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacacdn、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5 mg/L N-cad-Fc.④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14 d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现.RT-PCR检测无心肌标志性基因表达.结论:①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10 nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白Troponin T的表达早于心肌跳动的出现.②作为一种基质模犁来模拟细胞间黏附,2.5 mg/L N-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件.③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用.