构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

• 作者: 乔威 乔彤 冉峰 刘长建 周敏 张乐 李雷
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 内皮型一氧化氮合酶 真核表达载体 人脐静脉内皮细胞
• 年，卷（期）: 2008,（46）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 9080-9084
• 页数: 5页
• 分类号: R0329
• 字数: 5974字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.46.022

摘要

背景:内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题,对于生物人工血管的研制有重要意义.目的:构建内皮犁一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS,以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率,评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响.设计、时间及地点:单一样奉观察,实验于2005-07/2007-05在南京人学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成.材料:质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠.pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博上后贾立军馈赠,pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供.大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存.方法:采用分子生物学技术.先用限制性核酸内切酶Ecor I酶切质粒PCMV/eNOS.电泳回收3.6 kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列,克隆入质粒pcDNA3.1的Ecor I酶切位点,通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的Xho I酶切何点筛选其插入载体的方向,构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒.以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304).主要观察指标:①观察转染后对ECV304生长的影响.在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率.②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学榆测内皮型一氧化氮合酶基因的表达,测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量.⑨观察施加不同因素(L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME)对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响;同时检测此时ECV304生长所受影响.结果:以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后,其转染效率为(32.6±2.6)%,反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮含酶mRNA和蛋白表达,与对照组有明显差别:同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别:随着培养液一氧化氮浓度升高,ECV304生长曲线下降.结论:成功构建pcDNA3.1/eNOS,在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达,Ca2+是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件,ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘长建	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	95	421	12.0	15.0
2	乔彤	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	80	293	10.0	13.0
3	冉峰	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	39	193	8.0	11.0
4	周敏	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	85	381	9.0	16.0
5	张乐	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	23	126	7.0	10.0
6	乔威	南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科	6	39	3.0	6.0