HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

• 作者: 喻琼 徐筠娉 曾健强 李大成 杨宝成 苏宇清 邓志辉 高素青
• 来源期刊: 中华医学遗传学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 人类向细胞抗原 HLA-Cw基因 全长序列 克隆 测序
• 年，卷（期）: 2009,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 258-262
• 页数: 5页
• 分类号: R5
• 字数: 3803字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2009.03.005

摘要

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.