死亡素与泛素在大肠杆菌中的高效融合表达

• 作者: 任顺祥 孙强 张呈文 许小霞 金丰良
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 农学
• 关键词: 抗菌肽 死亡素 泛素 融合表达 纯化 活性检测
• 年，卷（期）: 2009,（5）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 495-501
• 页数: 7页
• 分类号: Q78|S43
• 字数: 5469字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0454-6296.2009.05.004

摘要

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽.为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR(recursive PCR,rPCR)扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA.将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46%.Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签.利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni2+-NTA亲和柱和HPLC纯化(纯化量为5.4 mg/L),Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带.电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致.利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制.本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素.