病原真菌DNA提取方法及简单重复序列聚合酶链反应体系的优化

• 作者: 杨艳秋 横山耕治 王丽 贺丹
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 真菌 基因组DNA提取 SSR-PCR 正交设计
• 年，卷（期）: 2009,（50）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 9924-9927
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 4441字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.50.025

摘要

背景:真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位.DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果.目的:建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的最佳组合.设计、时间及地点:DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06,2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行.材料:将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28℃培养3-7 d后,选取可疑菌落进行分离、纯化.方法:比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、GeneTLE~(TM)抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4个因素,在3个水平上根据L9(3~4)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数.主要观察指标:根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定最佳反应体系.结果:Gene TLE~(TM)抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法.SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据尺值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>Taq DNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为:模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP150 μmol/L,引物0.5 μmol/L.但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.结论:Gene TLE~(TM)提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单.根据正交试验的优化结果,SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 150 μmol/L,引物0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王丽	吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室	138	637	12.0	18.0
2	贺丹	吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室	32	176	7.0	12.0