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摘要:
背景:研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多.由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品.目的:构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1 mRNA的质粒标准品.设计、时间及地点:单一样本重复实验,于2007-1 1/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成.材料:SYBR ExScriptTM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMDl8-T Vector试刺盒等.方法:从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JMl09,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确.抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,最后稀释成梯度标准品.主要观察指标:重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性.结果:成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体.各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105-1012)copies/mL.各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%~1.16%.结论:实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品.
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文献信息
篇名 叉头转录因子1质粒标准品的构建
来源期刊 中国组织工程研究与临床康复 学科 医学
关键词 质粒标准品 叉头转录因子1 荧光定量-聚合酶链反应
年,卷(期) 2009,(7) 所属期刊栏目 组织构建与生活性因子
研究方向 页码范围 1263-1266
页数 4页 分类号 R342.2
字数 5037字 语种 中文
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