构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

• 作者: 伍卫 周淑娴 张玉玲 袁桂仪 雷娟
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: HCN4 腺病毒载体 骨髓间充质干细胞 基因转染
• 年，卷（期）: 2009,（45）
• 所属期刊栏目: 骨髓基质干细胞的培养与分化
• 页码范围: 8944-8948
• 页数: 5页
• 分类号: R394.2
• 字数: 5374字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.45.027

摘要

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	雷娟	中山大学附属第二医院心血管内科	66	370	11.0	17.0
2	周淑娴	中山大学附属第二医院心血管内科	106	528	12.0	18.0
3	伍卫	中山大学附属第二医院心血管内科	128	624	12.0	17.0
4	张玉玲	中山大学附属第二医院心血管内科	50	174	7.0	11.0
5	袁桂仪	中山大学附属第二医院心血管内科	12	25	2.0	5.0