重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定

• 作者: 吴朝阳 林建华 王长昇
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 脑源性神经营养因子 腺病毒载体 增强型绿色荧光蚩白 基因重组
• 年，卷（期）: 2009,（20）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 3947-3951
• 页数: 5页
• 分类号: R349.33
• 字数: 5287字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.20.031

摘要

背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	林建华	福建医科大学附属第一医院骨科	241	1331	18.0	23.0
2	吴朝阳	福建医科大学附属第一医院骨科	58	272	10.0	13.0
3	王长昇	福建医科大学附属第一医院骨科	25	54	4.0	6.0