重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 任凯 周可 彭亮权 徐小平 朱伟民 欧阳侃 熊建义 王大平 陆伟 黄俊锋
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 骨形态发生蛋白 表达载体 腺病毒 转染
• 年，卷（期）: 2009,（20）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 3942-3946
• 页数: 5页
• 分类号: R349.33
• 字数: 5670字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.20.030

摘要

背景:目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂,构建周期长,导致重组腺病毒构建的成功率较低.GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统,其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点.目的:构建含人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体,为应用骨形态发生蛋白2基因治疗的研究奠定基础.设计、时间及地点:单一样本规察,实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成.材料:pOTB7-BMP-2质粒、HEK293为ATTC产品;BLOCK-iTTMAdenovirus Expression System为Invitrogen产品;大肠杆菌DH5 α为Biontex产品.方法:用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2目的基因,并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析.将骨形态发生蛋白2基因亚克降到穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC3.1-BMP-2穿梭质粒,再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒载体中,线性化后转293细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2.主要观察指标:①目的基因骨形态发生蛋白2的聚合酶链反应扩增.②重组质粒TS-BMP2的构建.⑨重组pEC3.1-BMP2的构建.④重组pAd-BMP2的构建.⑤重组腺病毒的制备与鉴定.结果:正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA,并成功地构建其腺病毒载体,经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞,包装、扩增后得到入骨形态发生蛋白2重组腺病毒(rAd-BMP2),其滴度约为1×1010PFU/mL,该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2成骨作用的研究.结论:成功地构建重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体.