小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

• 作者: 傅启华 刘宏景 郁婷婷
• 来源期刊: 血栓与止血学
• 学科: 生物学
• 关键词: 尿激酶型纤溶酶原激活物 受体 结合 小鼠
• 年，卷（期）: 2010,（6）
• 页码范围: 259-263
• 分类号: Q517
• 字数: 3173字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-6213.2010.06.005

摘要

目的 尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应.本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸.方法 包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体.用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒.表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞.表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化.纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定.用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数.结果 用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、129、R31、Fal、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、14-30、W31的突变体M3.经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别.结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM.结论 小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	傅启华	上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科	66	367	10.0	15.0
2	郁婷婷	上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科	9	22	2.0	4.0
3	刘宏景	上海交通大学医学院附属新华医院检验科	3	12	2.0	3.0