负链RNA病毒反向遗传通用载体的构建与鉴定

• 作者: 张衡 张驰 曾祥兴 李卫中 李康生 王革非 陈幼莹
• 来源期刊: 癌变·畸变·突变
• 学科: 医学
• 关键词: 反向遗传 RNA病毒 载体
• 年，卷（期）: 2010,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 175-178
• 分类号: R373.1|Q939.4
• 字数: 2928字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-616X.2010.03.004

摘要

目的:用于负链RNA病毒的重组技术称为反向遗传技术,其核心需要构建一个具有双向启动子的反向遗传通用载体,可以分别正向转录翻译病毒复制所需酶系和负向转录病毒负链RNA.为此,构建负链RNA病毒反向遗传通用的载体.方法:为提高转染和表达效率,首先改造peDNA3载体,通过酶切删除peDNA3载体中非必需序列,在保留Amp抗性的前提下,通过酶切去除peDNA3载体中非必需的Kan抗性表达盒与CMV启动子前区.利用长引物合成含有反向pol I启动子与多克隆位点的基因片段.将合成后的片段酶切、补平粘端、连接,反向插入至经改造后的pcDNA3载体中,构建反向遗传通用表达载体.采用PCR检测、酶切鉴定以及DNA测序进行验证.结果:PCR检测、酶切鉴定以及DNA测序结果表明,载体构建正确,合成及插入序列与预期设计完全一致.结论:成功构建具有CMV与pol I双向启动子的反向遗传通用载体,为建立负链RNA病毒反向遗传平台提供了研究基础.