单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

• 作者: 单丽伟 王保莉 管楚状 范三红 郭蔼光
• 来源期刊: 生物化学与生物物理进展
• 学科: 生物学
• 关键词: T7核酸酶I 结构域交换 单活性结构域 二聚体稳定性 催化特性
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 426-432
• 页数: 7页
• 分类号: Q55
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00580

摘要

T7核酸酶Ⅰ(T7E Ⅰ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7E Ⅰ突变体,MBP-T7E Ⅰ(E20K)和His6-T7E Ⅰ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7E Ⅰ异源二聚体(T7E Ⅰ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7E Ⅰ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7E Ⅰ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7E Ⅰ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0 mol/L尿素或1.75～2.0 mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7E Ⅰ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.