一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用

• 作者: Kallaya Sritunyalucksan Vanvimon Saksamerprome 梁艳 黄倢
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 斑节对虾 RNA干扰 双链RNA 体内转录 大肠杆菌HT115 kazal型蛋白激酶抑制剂
• 年，卷（期）: 2010,（7）
• 页码范围: 1011-1017
• 分类号: Q789|S917
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1231.2010.06833

摘要

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用.以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300 nt)的方法.使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA.构建的发夹RNA表达载体含有494 bp的正向靶序列和403 bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91 bp即可成为100p环,而无需再次克隆加入.培养30 mL的细菌,即可得到1 mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一.为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μgdsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24 h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平.与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24 h内沉默血淋巴中的KPI基因.结果表明该方法是可大规模制备长的dsRNA的方法.