HIV-1型病毒蛋白R基因表达载体的构建及其在前列腺癌细胞系PC-3中的表达

• 作者: 刘平 卢春 樊卫飞 王子盾 王平
• 来源期刊: 江苏大学学报(医学版)
• 学科: 医学
• 关键词: 重组腺病毒 HIV-1型病毒蛋白R PC-3细胞
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 页码范围: 286-291
• 分类号: R730.5
• 字数: 4461字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-7783.2010.04.003

摘要

目的: 利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1 病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)基因的重组腺病毒,使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3,并在其中表达Vpr.方法: 自表达载体pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Vpr,经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌.挑选同源重组质粒,经Pac Ⅰ酶切后回收大片段,并将其转染包装细胞AD293.利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达.收集第一代重组病毒上清,使之感染AD293细胞得到第二代病毒,如此反复感染AD293细胞3～4轮,使病毒大量扩增.梯度稀释法测定病毒滴度后,分别以感染复数(MOI)为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3,荧光显微镜观察细胞中GFP表达,并利用RT-PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况.结果: 经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒,滴度为3.0×108 efu/ml.以MOI为5的重组腺病毒感染24 h后,80%以上的靶细胞能够表达GFP,RT-PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达.结论: 成功构建含Vpr基因重组腺病毒,并且病毒能够有效感染PC-3细胞,使得目的基因在其中获得大量表达,为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卢春	南京医科大学微生物学与免疫学系	92	236	7.0	9.0
2	刘平	南京医科大学第一附属医院肿瘤科	69	502	11.0	18.0
3	王平	南京医科大学微生物学与免疫学系	48	276	9.0	14.0
4	王子盾	南京医科大学微生物学与免疫学系	7	4	1.0	1.0
5	樊卫飞	南京医科大学第一附属医院肿瘤科	4	3	1.0	1.0