分泌人内皮抑素的微囊化基因工程细胞系的构建

• 作者: 刘锐 宿罡 李红 蔡善君 詹文芳 谢兵
• 来源期刊: 中华眼底病杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 内皮抑素类/生理学 微囊藻属/细胞学 细胞系
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 367-371
• 分类号: R774.1|R34
• 字数: 5681字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2010.04.16

摘要

目的 建立能稳定分泌人内皮抑素(hES)的基因工程细胞系,观察内皮抑素(ES)蛋白和hES的表达.方法 以hES重组质粒pcDNA3.0(pcDNA3-Endo)为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得hES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)质粒中,获得重组质粒pEGFP-N1-Es;利用阳离子脂质体介导将其转染到人胚胎肾细胞(HeK-293)细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hES/293,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测转染细胞上清中ES蛋白的表达;用海澡酸钠壳聚糖(ACA)微囊包裹hES/293细胞,分别收集培养3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293细胞的培养上清液,Western blot法检测包裹后培养液上清中hES的表达.结果 重组质粒pEGFP-N1-ES经限制性核对内切酶HindⅢ和限制性核酸内切酶BamH Ⅰ双酶切得到4700碱基对(bp)和600 bp 2条带;PCR扩增出600 bp条带;测序结果与NCBI上序列比对软件(BLAST)比对,同源性达到100%.pEGFP-N1-ES转染HeK-293细胞,经G418筛选后获得阳性克隆,选取筛选的10株单克隆细胞培养上清液进行Western blot分析,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带.在ACA微囊内hES/293细胞随着培养时间的延长,细胞团逐渐长大,充满整个囊内空间.培养3、7、21、35 d时,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带.结论 重组pEGFP-N1-ES真核表达载体构建正确,转染HeK-293细胞后可有效的表达hES蛋白,并能分泌到细胞外;微囊化hES/293细胞产生的ES蛋白可以自由扩散出微囊膜外,并呈持续性表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李红	遵义医学院附属医院眼科	64	222	8.0	12.0
2	蔡善君	遵义医学院附属医院眼科	46	169	5.0	11.0
3	刘锐	遵义医学院附属医院眼科	11	34	3.0	5.0
4	谢兵	遵义医学院附属医院眼科	28	72	5.0	6.0
5	宿罡	遵义医学院附属医院眼科	24	47	4.0	5.0
6	詹文芳	遵义医学院附属医院眼科	7	6	1.0	2.0