高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定

• 作者: 周波 孙芳 李启富 林雪波 段炼
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 医学
• 关键词: PRKCD基因 腺病毒 高葡萄糖 核转位 人脐静脉内皮细胞
• 年，卷（期）: 2010,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 18-21
• 页数: 4页
• 分类号: R587.1
• 字数: 4531字
• 语种: 中文

摘要

目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定.方法:设计含Age Ⅰ和Nhe Ⅰ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经Age Ⅰ和Nhe Ⅰ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ads-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCIDSO法测定病毒滴度.分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达.结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功.测得病毒滴度为1.0×10~(10) IU/ml.激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P<0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(P<0.05),提示核转位明显.结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李启富	重庆医科大学附属第一医院内分泌科	230	1066	16.0	22.0
2	周波	重庆医科大学附属第一医院内分泌科	84	303	9.0	13.0
3	林雪波	重庆医科大学附属第一医院内分泌科	5	25	3.0	5.0
4	孙芳	重庆医科大学附属第一医院内分泌科	6	26	3.0	5.0
5	段炼	第三军医大学新桥医院内分泌科	11	26	3.0	4.0